ENSAYO COMETA

El termino cometa se emplea para identificar la migración de las células individuales de ADN.

Ostling y Johanson en 1984 fueron los primeros en desarrollar una técnica de electroforesis en un microgel para detectar daños en el ADN a nivel celular. En esta técnica, las células embebidas en un gel de agarosa se colocan en un portaobjetos. Las células eran lisadas por detergentes y sales, y así se liberaba el ADN por electroforesis en condiciones neutras.

Las células con mayor frecuencia de roturas de ADN de doble cadena (DSB Double Strand Breaks) muestran un aumento en la migración del ADN hacia el ánodo. La migración del ADN se cuentifica mediante tinción con bromuro de etidio y midiendo la intensidad de la fluorescencia. La migración del ADN se observa con ayuda de un microscopio fotométrico.

Tiempo después (Singh et al, 1988) introdujeron una técnica en microgel que implica una electroforesis en condiciones alcalinas (pH 13) para la detección de lesiones de ADN en células individuales. En pH 13, el aumento en la migración de ADN se asocia con el aumento en los niveles de extensión SSB (Single Strand Breaks), las SSB se asocian con escisiones incompletas en los sitios de reparación y las ALS (Alkali-Labile Sites).

Dos años después (Olive et al, 1990) presentaron otra versión en el que el pH se modifica a 12.3.

Entre las ventajas de este ensayo se encuentran:

  1. Detecta bajos niveles de daño en el ADN.

  2. Requiere un bajo número de células por muestra.

  3. Es flexible.

  4. Es de bajo costo.

  5. Es de fácil aplicación.

  6. Se requieren bajas cantidades de reactivos en el ensayo.

  7. Requiere periodos cortos de tiempo (hasta días) para completar el experimento.

En forma resumida esta es la metodología:

Cometa 2.1. Se preparan los portaobjetos con capas de células en agarosa.

2. Lisis de las células y liberación del ADN.

3.  Exposición a pH alcalino (pH 13) para obtener una hebra de ADN y expresar los sitios lábiles alcalinos (ALS) así como roturas de cadena simple (SSB).

4. Electroforesis en condiciónes alcalinas (pH 13).

5. Neutralización alcalina.

6. Tinción  y visualización del ADN y el cometa.

7. Puntuación del cometa.

REFERENCIAS Y RECOMENDACIONES

Tice, R. R., Agurell, E., Anderson, D., Burlinson, B., Hartmann, A., Kobayashi, H., Miyamae, Y., Rojas, E., Ryu, J. C., Sasaki, Y. F. 2000. Single Cell Gell / Comet Assay: Guidelines for In Vitro and In Vivo Genetic Toxicology Testing. Environmental and Molecular Mutagenesis 35: 206 – 221. LINK DEL RESUMEN: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10737956

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